延边黄牛Titin基因多态性及其与肉质性状的相关分析.pdf

发布时间：2022-05-29 发布人：admin 分类：说明书资料大小：0.49M 资料格式：pdf 举报版权申诉

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5 10 15 20 25 30 35 40 中国科技论文在线延边黄牛 Titin 基因多态性及其与肉质性状 http://www.paper.edu.cn 的相关分析# 李香子1，田万年2，严昌国1** （1. 延边大学农学院，吉林延吉 133002； 2. 吉林农业科技学院动物科学学院，吉林吉林 132101）摘要：利用 PCR-RFLP 技术检测了延边黄牛群体 104 个个体肌联蛋白基因（Titin）多态性，找到了 Titin 基因 DNA 序列中的 1 个突变位点 G70553T，并将限制性酶切位点多态性与延边黄牛肉的肉色、脂肪酸和肌内脂肪含量等肉质性状间的相关性进行了分析。结果表明：延边黄牛群体 TT 型与 L*24、油酸存在一定的正相关（p<0.05）；GG 型与 c*24、硬脂酸存在一定的正相关（p<0.05）；TG 型肌内脂肪含量极显著高于 TT 型和 GG 型（p<0.01）。关键词：延边黄牛；PCR-RFLP；Titin；肉质性状中图分类号：S827 Polymorphism of Titin Gene and its Association with Meat Quality Traits in Yanbian Yellow Cattle LI Xiangzi1, TIAN Wannian2, YAN Changguo1 (1. College of Agriculture,Yanbian University, JiLin YanJi 133002; 2. College of Animal Science, Jilin Agricultural Science And Technology College, JiLin JiLin 132101) Abstract: Polymorphisms of Titin gene were detected in 104 Yanbian Yellow Cattle by PCR-RFLP, One polymorphic site G70553T was found, The relationship between polymorphism of Titin gene and meat quality traits (meat color, fatty acid intramuscular fat(IMF) content) was analyzed. The results showed as follows: The genotype TT was positively correlated with L*24, oleic acid (P<0.05); The genotype GG was positively correlated to c*24, stearic acid(P<0.05); The genotype TG exhibited significantly higher IMF content than TT and GG(P<0.01). Keywords: Yanbian Yellow Cattle; PCR-RFLP; Titin; Meat Quality 0 引言牛肉品质一直是国内外牛肉生产者、消费者和科研人员关注的重要问题，影响牛肉品质的因素很多，包括肌纤维直径、肉色、系水力、肌内脂肪含量等[1]。肌内脂肪含量（intramuscular fat,IMF）是影响牛肉嫩度和风味的一个重要因素，肌内脂肪含量过低，使牛肉的风味显著下降，当肌内脂肪含量达到 10%时，可产生理想的大理石花纹，从而形成优质的高档牛肉[2]。肌内脂肪是一个遗传力较高的性状，因其在牛活体中无法检测，在牛育种中无法对其进行有效的选育。因此利用 DNA 标记辅助选择（MAS）寻找控制 IMF 的基因，对其进行选育可提高 IMF 含量，从而改善牛肉品质。 Titin 是已知最大的脊椎动物蛋白，是一种肌纤维蛋白，该蛋白可促进肌纤维的延伸[3-4]。 Titin 具有复杂的分子折叠的功能，主要参与糖代谢、蛋白氨基酸磷酸化、肌收缩、调控横纹肌收缩、蛋白氨基酸自磷酸化等能影响骨骼肌正常的生理功能[5-6]。研究发现肌联蛋白突变导致的肌联蛋白改变与 DCM、肥厚型心肌病、心力衰竭的发生相关[7-8]。本试验以延边黄基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20102201120002) 作者简介：李香子，(1975-)，女，副教授，主要研究方向：反刍动物脂肪代谢调控与高档牛肉肉质性状研究。通信联系人：严昌国，(1960-)，男，教授，主要研究方向:动物遗传育种与繁殖。 E-mail: ycg@ybu.edu.cn.com - 1 -

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 牛为研究对象，采用 PCR-RFLP 方法对 Titin 多态位点进行检测，并与延边黄牛肉质性状进行关联分析，旨在寻找与肉质性状有关的遗传标记位点，为延边黄牛的牛肉质性状的标记辅助选择提供依据。 1 材料与方法 45 1.1 实验材料 104 头延边黄牛来自吉林省珲春天一牧场。屠宰后采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠和瘤胃等组织（用于组织表达谱研究），每次采样的背最长肌部位保持一致，一部分置于液氮中速冻，―70℃保存；一部分保存于―20℃，用于测定 IMF 含量。同时收集每一头牛的血样，所有血液样品均用 ACD 抗凝处理。 50 1.2 试验方法 1.2.1 延边黄牛血样基因组 DNA 的提取血液基因组 DNA 提取采用普洛麦格(promega)公司血液基因组 DNA 提取试剂盒提取，血液基因组提取步骤按说明书进行。 1.2.2 引物设计与合成 55 根据已发表的牛 Titin 基因序列设计一对引物，扩增片段长度为 538bp，引物由上海生 60 65 物工程技术有限公司合成，序列如下：上游：5′—TATGGGAGGTTGTTTCTGCTA—3′ 下游：5′—TGATTCACTTGACCTCACCGT—3′ 1.2.3 肉质性状数据的测定肉质性状按我国肉牛屠宰试验暂行标准测定肉质性状，主要包括：肉色、肌肉氨基酸含量、肌肉脂肪酸含量。肉质分析中的肌内脂肪含量、肉色和脂肪酸含量测定部分是在吉林农科院分析测试中心进行。 1.2.4 PCR-RFLP 分析 PCR 产物检测后进行限制性酶切，反应程序条件： PCR产物 5µL 10×Buffer 1.0µL 内切酶（10U/µL）0.5µL ddH2O 3.5µL 总体系 10.0µL 70 37℃酶切 12h，酶切产物用 2%的琼脂糖凝胶电泳拍照分析，观察基因型。 1.2.5 PCR 产物纯化与测序 PCR-RFLP 分析后，不同基因型个体用采用宝生物 DNA 回收试剂盒回收纯化，送往上海英俊公司进行测序。 - 2 -

中国科技论文在线 1.2.6 数据处理及统计分析 http://www.paper.edu.cn 75 DNA 序列经 DNA Star 软件包编辑、正反链核对后与原始序列进行比对分析，寻找突变位点。运用 SPSS 软件，采用最小二乘法分析不同基因型与肉质性状的相关性。 1.2.7 差异表达基因的组织表达谱分析 80 提取延边黄牛背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃和小肠组织和器官的总 RNA，提取总 RNA 后翻转录成 cDNA，以 cDNA 为模板进行半定量 RT-PCR 扩增，β-actin 为内参基因，每个样本重复 3 次。 2 实验结果 2.1 PCR 扩增产物检测结果用合成的引物以血液基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，所得产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度与预期的大小一致(图 1)。图1 Titin的扩增产物 M：DL2000 marker；1-9：扩增产物 2.2 牛 Titin 基因的 SNPs 研究 PCR 产物经过限制性内切酶切 Msp I 酶切后出现 3 种带型：当该位点为 T 时，不能被 Msp I 酶切，酶切后只能有一个片段，长度为 538bp（A 等位基因）；当该位点为 G 时，Msp I 酶切后产生两个片段，长度分别为 107 bp 和 431 bp（G 等位基因）。TT 基因型只有一个片段 538bp；TG 基因型有 3 个片段，538bp，431bp 和 107bp；GG 基因型有两个片段 431bp 和 107 bp(图 2)。 85 90 95 100 - 3 - 图 2 延边黄牛 TitinMsp I-RFLP 多态分型结果 M：DL2000 marker；1：TT 型；2：TG 型；3，4：GG 型

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 70553 G > T XM_002685260 图 3 不同基因型测序结果 2.3 延边黄牛 Titin 基因多态位点的遗传分析利用 PCR-RFLP 技术，在延边黄牛群体中进行 TitinMsp I-RFLP 多态性检测，如表 3.9 所示。对该位点的基因型频率和基因频率进行统计后发现，延边黄牛群体 TT 基因型个体较多，GG 型个体较少；G/T 等位基因频率分别为：0.33 和 0.67。该位点等位基因纯合度为 0.40，位点杂合度为 0.60，多态信息含量为 0.52，接近高度多态。延边黄牛群体在该位点均处于 Hard-Weinberg 平衡状态。表 1 延边黄牛群体 Titin Msp I-RFLP 遗传多态性指标指标 Index 基因型频率（PGG/PGT/PTT）Genotype frequency 基因频率 Gene frequency 位点纯合度 Homozygosity 位点杂合度 Heterozygosity 多态信息含量（PIC）Polymorphism information content 哈代-温伯格平衡检验 Hardy-Weinberg equilibrium test 延边黄牛群体 yanbian yellow cattle 0. 14/0.38/0.48 0.33/0.67 0.40 0.60 0.52 平衡 Equilibrium 105 110 115 2.4 Titin 基因 G70553 T 不同基因型对延边黄牛肉质性状的影响 120 对延边黄牛 Titin 基因 AA、AB、BB 三种基因型所对应的各肉质性状均值进行差异显著性检验发现，不同基因型间的 L*（亮度）和 c*（彩度）存在显著差异，基因型 TT 在 L*24 性状上显著高于基因型 AB（P＜0.05），说明基因型 TT 对 L*存在一定的正面影响；基因型 GG 在 c24*（彩度）性状上显著高于基因型 TG（P＜0.05），说明基因型 GG 对 c24*（彩度）存在一定的正面影响，见表 2。表2 Titin基因各基因型肉质性状均值差异显著性检验 L*0 L*24 a*0 a*24 b*0 b*24 c*0 c*24 h00 h024 TT 38.83±1.00 39.76±0.38a 11.06±0.79 9.84±0.72 13.02±1.09 12.70±0.95 26.75±2.58 24.68±1.18ab 47.32±0.94 49.62±0.83 TG 38.10±0.31 38.77±0.47b 10.78±0.64 9.70±0.63 13.15±0.76 12.63±0.96 27.18±2.28 24.25±1.64b 47.04±1.15 49.69±1.08 GG 38.32±0.41 39.13±0.21ab 10.55±0.50 9.64±0.09 13.07±0.88 12.65±0.91 26.79±1.98 24.89±1.04a 47.83±0.57 49.56±0.79 125 注:①同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P＞ 0.05)。 L② ，亮度；A，红色度；B，黄色度；C，彩色度；H，彩色角。③不同数字表示检测时间（h）。表 3 为延边黄牛 Titin 基因不同基因型各脂肪酸性状均值差异显著性检验结果。在棕榈酸组成上基因型 TG 显著高于基因型 TT 和 GG（p<0.05），说明基因型 TG 对硬脂酸的组成有一定的正面影响；在油酸上基因型 TT 值显著高于基因型 GG 和 TG（p<0.05），说明基因 - 4 -

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 130 型 TT 对油酸有一定的正面影响。在硬脂酸上基因型 GG 值显著高于基因型 TG（p<0.05），说明基因型 GG 对硬脂酸有一定的正面影响。表 3 延边黄牛 Titin 基因各基因型与脂肪酸性状相关性分析（单位：%） TT TG GG 2.4193±0.2772 26.9048±1.4104a 4.3855±1.1796 14.8916±2.6924ab 49.7559±1.4240a 2.3029±0.3821 肉豆蔻酸（％）棕榈酸（％）棕榈油酸（％）硬脂酸（％）油酸（％）亚油酸（％）各基因型个体肌内脂肪含量如表 4 所示。方差分析结果表明，TG 型肌内脂肪含量极显著高于 TT 型和 GG 型（p<0.01），而 TT 型和 GG 型差异不显著，但 GG 型个体肌内脂肪含量有高于 TT 型个体的趋势。 2.9294±0.4066 30.443±2.1654b 3.9838±0.3879 13.9953±1.2251b 46.9319±2.1184b 2.3753±0.2074 2.6407±0.4145 27.4564±1.0884a 3.1898±0.3554 15.6391±1.8592a 46.8707±1.1330b 2.3733±0.3013 表 4 延边黄牛 Titin 基因各基因型与肌内脂肪含量的方差分析性状肌内脂肪基因型 TT TG GG 样本数 14 40 50 2.5 延边黄牛 ACTA1 基因的组织表达谱分析肌内脂肪含量（%） 8.38±2.21 B 16.38±3.56 A 9.12±1.87 B 为了解牛 Titin 基因在不同组织器官中的表达情况，以牛背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠和瘤胃等组织器官为材料，提取 RNA 反转录 cDNA. 设计基因特异引物，应用 RT-PCR 方法，以 β-actin 为内参，分析该基因在不同组织中的表达情况，见图 4。结果表明：Titin 基因在背最长肌和心肌中表达量最高，肾脏和瘤胃中表达量较少，肝脏、脾脏、肺脏和小肠中几乎不表达。 M：DL2000Marker；1:心脏;2:肝脏 3:脾脏;4：肺脏;5:肾脏;6:瘤胃;7:小肠;8:肌肉图 4 Titin 基因的组织表达谱 - 5 - 135 140 145 150

中国科技论文在线 3 讨论 http://www.paper.edu.cn 155 160 165 有关牛的 Titin 基因的研究报道较少，Seung[9]等报道 Titin 基因在高、低大理石花纹等级牛肉中差异表达。本试验通过对该基因的组织表达谱分析表明，该基因在背最长肌和心肌中表达量最高，肾脏和瘤胃中表达量较少，在肝脏、脾脏、肺脏和小肠中几乎不表达，提示该基因可能与肉质性状相关。Wimmers 等[10]研究，发现 Titin 基因与猪肉肉色、pH 等肉质性状相关。本试验发现 Titin 基因 Titin Msp I-RFLP 与 L*（亮度）、c*（彩度）、棕榈酸、硬脂酸和油酸存在一定的相关关系，说明了 Titin 基因可能是一个影响肉质性状的主效基因。目前有关与牛肌内脂肪含量相关的分子遗传标记的研究报道较少，李志才等[11]研究表明， H-FABP 基因的多态性与湘西黄牛的牛肉肌内脂肪含量和大理石花纹间存在显著的相关性。Takahisa 等[12]研究发现 Titin 基因 g.231054C>T 位点与日本和牛大理石花纹等级存在显著相关性。本研究通过 PCR-RFLP 方法在 Titin 基因发现了多态位点，对不同基因型的肌内脂肪含量方差分析，结果表明杂合子 TG 肌内脂肪含量显著高于两种纯合子的趋势，表现出超显性效应。通过对肌内脂肪含量的不同效应提示，Titin 基因发现的 PCR-RFLP 标记可应用到延边黄牛肌内脂肪的选育工作中。该基因杂合体具有超显性效应，在今后延边黄牛育种工作中可以在父本和母本分别选育纯合子，通过父本和母本的杂交获得杂种优势，以提高肌内脂肪含量。此外通过基因平衡检验表明，该位点处于基因平衡状态，说明该位点未受到选择压力的影响，延边黄牛在肌内脂肪含量这一性状未进行选择，利用该遗传标记可以对牛群进行选择。由于本研究中所检测的样本数量较少，研究结果有待于加大延边黄牛群体数进 170 行进一步验证。 [参考文献] (References) [1] 张书江，单安山.猪肉质的评价指标及其影响因素[J].中国饲料，2007（13）：30-32. [2] 邓桂馨.肉牛 CAST 基因和 HFABP 基因多态性及其与肉品质性状关系的研究[D].北京:中国农业科学院,2003. [3] WALKER JS,TOMBE P P.Titin and the developing heart[J].Circ Res,2004,94(7):860-862. [4] FUKUDA N, GRANZIER H L,KURIHARA S,et a1.Physiological functions of the giant elastic protein titin in mammalian striated muscle[J].J Physiol Sci, 2008,58(3):151-159. [5] 刘星，饶莉，周斌，等. 肌联蛋白基因突变与中国人扩张型心肌病[J]. 中华心血管病杂志,2008,36 （12）:87-91. [6] 任利群，刘乃丰. 肌联蛋白的结构特点与生理功能[J]. 国外医学内科学分册,2006,5（33）:215-217. [7] Sheterline P,Sparrow JC.Actin.Protein Profile,1994,1（1）:1-121 [8] Luo L. Actin cytoskeleton regulation in neuronal morphogenesis and structural plasticity[J]. Annu Rev Cell Dev Biol,2002,18:601-635. [9] Seung Hwan Lee,Yong Min Cho,Sang Hong Lee,et al. Identification of marbling-related candidate genes in M. longissimus dorsi of high- and low marbled Hanwoo (Korean Native Cattle) steers[J]. BMB reports 2008; 41(12): 846-851. [10] Wimmers K, Murani E, Te Pas MF,Chang KC, Davoli R, Merks JW, Henne H, Muraniova M, da Costa N, Harlizius B, Schellander K, Böll I, Braglia, S, de Wit AA, Cagnazzo M, Fontantanesi L, Prins D, Ponsuksili S. Associations of functional candidate genes derived from gene-expression profiles of prenatal porcine muscle tissue with meat quality and muscle deposition. Anim Genet.2007, 38(5):474-484. [11] 李志才，易康乐. 湘西黄牛的 H-FABP 基因对大理石花纹和肌内脂肪含量相关性分析[J]. 中国牛业科学,2010,36(1):1-4. [12] Takahisa Yamada,Seiki Sasaki, Shin Sukegawa, et al. Association of a single nucleotide polymorphism in titin gene with marbling in Japanese Black beef cattle[J]. BMC Research Notes 2009,2:78. 175 180 185 190 195 - 6 -

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