5 10 15 20 25 30 35 40 中国科技论文在线 pEGFP-N2-CASK 表达质粒的构建及鉴定 http://www.paper.edu.cn 陈鸿1，李原1，朱云霞2，王尧1** （1. 东南大学附属中大医院内分泌科，南京 210009； 2. 南京医科大学江苏省人类功能基因组重点实验室，南京 210029） 摘要：【目的】构建能表达大鼠 CASK 蛋白的质粒。【方法】设计一对用于扩增大鼠 CASK 的编码序列（Coding Sequence，CDS）的引物，以大鼠胰岛β细胞系 INS-1 细胞中提取的总 RNA 逆转录所得的 cDNA 为模板，经过 PCR 扩增目的基因片段，与表达载体 pEGFP-N2 连接后 转化 DH5α感受态细胞，均匀涂布于含卡那青霉素（Kana+）的琼脂平板上，筛选阳性菌落， 提取质粒进行酶切鉴定并送基因公司测序分析。经测序证实插入的片段序列与设计序列完全 一致的重组质粒转染 INS-1 细胞后，用 Western blot 的方法鉴定表达质粒构建是否成功。 【结果】重组质粒经单酶切和测序鉴定证实插入序列完全一致，融合蛋白 pEGFP-N2-CASK 在 INS-1 细胞中成功表达。【结论】成功构建大鼠 CASK 融合蛋白表达质粒 pEGFP-N2-CASK。 关键词：CASK；构建；pEGFP-N2；表达 中图分类号：R587.1 Construction and identification of expression plasmid pEGFP-N2-CASK Chen Hong1, Li Yuan1, Zhu Yunxia2, Wang Yao1 (1. Department of Endocrinology , Zhongda Hospital, Southeast University , NanJing 210009; 2. Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, NanJing 210029) Abstract: Objective To construct the expression plasmid of rat CASK protein. Methods Designed a pair of parimers used to amplify the coding sequence of the rat CASK, the cDNA was reverse transcriptased form total RNA extracted from the rat pancreatic islet beta cells Ins-1 as a template, after amplification the target gene fragment was inserted into the vector of pEGFP-N2, and transfected with competent cells DH5α, the positive clones were identified by agar plate containing kanamycin, and the recombinant plasmids were extracted and confirmed by complete sequencing. Transfect the recombinant plasmids confirmed by sequencing that the inserted fragment and design sequence is exactly the same into INS-1 cells，and identify if the expression plasmid is successful by western blot. Results Recombinant plasmid by single enzyme digestion and sequencing confirmed the insertion sequence is exactly the same, fusion protein pEGFP-N2-CASK was successfully expressed in INS-1 cells. Conclusion The expression plasmid pEGFP-N2-CASK of rat CASK protein is successfully constructed. Keywords: CASK; construct; pEGFP-N2; expression 0 引言 研究证实钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase，CASK）是一种多结构域骨架蛋白，利用其多蛋白结构域，募集或组织其它 蛋白，以协调胞质和胞核中的信号转导通路[1]，参与神经元的发育和神经递质的释放。国外 的研究[2]和我们的实验证实在胰岛和胰岛细胞中有丰富的 CASK 基因的表达，但功能尚不清 晰。为了深入研究 CASK 基因在胰岛和胰岛细胞中的作用，我们利用分子生物学技术，构 建 CASK 基因的表达质粒，并转染 INS-1 细胞，利用 Western blot 的方法鉴定质粒构建是否 成功。 作者简介：陈鸿，（1986-），女，研究生。 通信联系人：王尧，（1964-），女，硕士生导师。E-mail: wang_yao100@163.com - 1 - 

中国科技论文在线 1 材料与方法 45 1.1 材料 http://www.paper.edu.cn 50 大鼠胰岛β细胞系 INS-1、pEGFP-N2 质粒、DH-5α 感受态（由韩晓教授，南京医科大 学江苏省人类功能基因组重点实验室提供），RPMI-1640、胎牛血清（美国 GIBCO 公司）， Trizol、Lipofectamine 2000（美国 Invitrogen 公司），ReverTra Ace-α 反转录试剂盒（日本东 洋纺），质粒抽提试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、胶纯化试剂盒（美国 Axygen 公司），限 制性内切酶、DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker（日本 TaKaRa 公司），β-巯基 乙醇（美国 Sigma-Aldrich 公司），DC 蛋白浓度测定试剂盒（美国 Bio-Rad 公司），CASK 抗体、α-tubulin 抗体（美国 Santa Cruz 公司），ECL plus、显影定影液（美国 Amersham 公 司），PVDF 膜（美国 Millipore Billerica 公司）。引物合成在上海捷瑞公司进行，测序在 上海英骏公司进行。 55 1.2 大鼠胰岛 β 细胞系 INS-1 细胞 cDNA 的获得 用 Trizol（Invitrogen）试剂提取大鼠胰岛 β 细胞系 INS-1 细胞总 RNA，用紫外分光光度 计进行 RNA 定量及纯度分析，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。以 1ugRNA 为模板， 按 ReverTra Ace-α（TOYOBO）反转录试剂盒说明书操作，反应体系为 20ul，进行反转录 （30℃ 10min；42℃ 20min；99℃ 5min；4℃ 5min），扩增得到大鼠胰岛 β 细胞系 INS-1 细胞 cDNA。 1.3 CASK 表达质粒的构建 根据 GenBank 的大鼠 CASK 编码序列，设计一对引物用于扩增大鼠 CASK 编码序列， 引 物 序 列 为 : 上 游 ： TAACGCGTCGACATGGCCGACGACGACGTGCTG ， 下 游 ： ATTCCGCTCGAGCTAATAGACCCAGGAGACCGG，上，下游引物的 5'端分别设计了限制 性内切酶 XhoI 和 SalI 识别序列及保护性碱基。以反转录获得的 INS-1 细胞 cDNA 为模板， 反应体系为 20ul，进行 PCR 扩增（98 ℃ 5min；3 步循环：98℃ 10S，60℃ 15S，72℃ 3min， 35 个循环；72℃ 10min），扩增的目的片段为大鼠 CASK 的 CDS 区，全长 2727bp。扩增 片段经切胶纯化后和 pEGFP-N2 载体质粒均用 XhoI 和 SalI 限制性内切酶进行双酶切，后 将两者用 T4 连接酶连接后转化至 DH-5α 感受态细菌，于含卡那青霉素（Kana+）的琼脂 平板上培养，挑取数个大小适中的单克隆，用含卡那青霉素的 LB 培养基进行扩增，提取质 粒后经酶切鉴定阳性的质粒送公司测序鉴定。 1.4 INS-1 细胞瞬时转染 转染前一天将 INS-1 细胞接种于 6 孔板，使转染时细胞密度大于 80%。以不含抗生素的 细胞培养液稀释 Lipofectamine 2000，室温静置 5min，与同样稀释的表达质粒混合，室温静 置 20min，每孔加入 500ul 脂质体质粒复合物，培养箱培养 4-6h 后更换正常培养液，48h 后 收取细胞。 1.5 Western blot 检测 细胞总蛋白提取及浓度测定按说明书操作。蛋白于沸水中充分变性，上样于 SDS-PAGE 胶孔中，用 80V 电压使样品通过浓缩胶，待样品进入分离胶后，换成 120V 电压继续电泳， 使蛋白分离。电泳结束后，100V 电压于冰上转膜 1 h。转膜完毕后，以脱脂奶粉室温封闭 60 65 70 75 80 - 2 - 

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 1h。依次结合一抗、二抗后，使用 ECL-plus 显色液于暗室中曝光、显影、定影。 2 结果 2.1 CASK 基因的 PCR 扩增和重组表达质粒的构建及鉴定 用上述设计的引物，以 INS-1 细胞 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，用 0．8％的琼脂糖凝 胶电泳进行鉴定，可见一条扩增片段，大小约为 2.7kb，与预期大小一致（图 1A）。将 PCR 产物和表达载体 pEGFP-N2 分别以限制性内切酶 XhoI 和 SalI 进行双酶切得到具有粘性末端 的目的基因片段和线性载体片段，大小分别为 2.7kb 和 4.7kb（图 1B）。将纯化的 PCR 产物 连接到质粒 pEGFP-N2 构建成 pEGFP-N2-CASK 重组质粒。选定一载体的多克隆位点及片段 的偏心位均存在的单酶切位点 BamHI，将该重组质粒经限制性酶 BamHI 酶切鉴定和序列测 定，重组质粒单酶切得到 2.0kb 和 4.7kb 大小的两个片段（图 1C）。 85 90 marker PCR产物 5000bp 2500bp 5000bp 2500bp (A) marker 1 2 marker 1 2 5000bp 2500bp (B) (C) 图1.表达质粒的构建 Fig. 1 Construction of the expression plasmid 2.2 Western blot 鉴定 CASK 重组蛋白 重组质粒转染 INS-1 细胞 24h 后收取蛋白进行 Western blot 免疫印迹，对照组为转染的 pEGFP-N2 空载质粒。结果可见，与对照组相比，在 127kD 处有一条带，符合 GFP-CASK 融合蛋白相对分子量，证明构建的重组质粒确实能过量表达 CASK 蛋白。 co ntrol p E G F P- N 2-C A S K GFP-CASK CASK CASK Tubulin 图2.INS-1细胞中CASK蛋白过量表达 Fig. 2 Overexpression of CASK in INS-1 cells 3 讨论 CASK 属于膜相关鸟苷酸家族成员，具有 MAGUK 家族的共同结构和功能特征，普遍 存在于心、脑、肝、肌肉和胰腺等组织，多定位于邻近基底膜的细胞质中[3]，目前对于 CASK 蛋白功能的研究主要集中在神经系统中，其在神经细胞的胞膜、胞浆、胞核都有分布。CASK 具有多个结构域，通过其不同的结构域与多种膜蛋白及下游效应分子相互作用，参与不同的 生物学过程[4,5]。CASK 主要定位于细胞连接处，参与了细胞内外信号的传递，CASK 还可 以结合肌动蛋白结合蛋白 4.1，并与肌动蛋白等细胞骨架连接，从而参与细胞骨架的构建。 - 3 - 95 100 105 

110 115 120 125 130 135 140 145 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 研究发现，CASK 可以从细胞膜进入细胞核，与 Tbr-1 结合，调节基因的转录过程[6,7,8]。因 此，CASK 通过其蛋白结构域，形成多蛋白复合物，在细胞间相互作用、细胞增殖、凋亡及 癌变等过程中都发挥了重要的作用。 近期有研究发现，hCASK 通过 DNA 结合抑制剂 1（Id1）导致了人脐静脉内皮细胞 ECV304 细胞生长的抑制。hCASK 很可能通过 Id1 和 E2A 信号通路来诱导 p21 基因表达， 从而在 ECV304 细胞上进一步调节细胞周期和细胞增殖[9]。而胰岛 β 细胞中，存在有 CASK 大量表达，其是否也可参与调节胰岛细胞的功能或细胞的增殖和凋亡等过程，尚不清楚。我 们前期的实验结果表明，在胰岛细胞中 CASK 基因表达明显；在高脂状态下，伴随着胰岛 β 细胞的分泌功能的受损，CASK 的基因及表达水平均降低，我们推测，CASK 可能也参与了 脂肪酸诱导的胰岛 β 细胞功能的损伤。为进一步明确 CASK 基因在胰岛细胞中的作用的分 子机制，我们构建了大鼠 CASK 基因的表达质粒，以期对我们的研究提供有效的手段。 本实验从大鼠胰岛 β 细胞系 INS-1 细胞中提取总 RNA，应用 PCR 技术，扩增获得 CASK 基因编码序列片段，克隆入表达载体 pEGFP-N2，对重组质粒进行酶切和测序鉴定后，成功 构建了 pEGFP-N2-CASK 表达载体。应用 Lipofectamine 2000 脂质体介导法转染 INS-1 细胞， 提取总蛋白后进行 Western blot 免疫印迹，证实 CASK 蛋白确实过量表达。这将为进一步研 究其在胰岛 β 细胞中的生物学效应及机制打下基础。 [参考文献] (References) [1] Sun RJ, Su YY，Zhao XD, et al.Human calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase regulates the expression of p21 via the E2A transcription factor. Biochem[J], 2009,419:457-466. [2] Suckow AT, Comoletti D, Waldrop MA, et al. Expression of Neurexin, Neuroligin, and Their Cytoplasmic Binding Partners in the Pancreatic Beta-Cells and the Involvement of Neuroligin in Insulin Secretion. Endocrinology, 2008, 149(12): 6006-6017. [3] Blair HJ, Reed V, Gormally E, et al. Positioning of five genes (CASK, ARX, SAT, IMAGE cDNAs 248928 and 253949) from the human X chromosome short arm with respect to evolutionary breakpoints on the mouse X chromosome. Mamm Genome, 2000, 11(8): 710-712. [4] Hsueh YP. The role of the MAGUK protein CASK in neural development and synaptic function. Curr Med Chem, 2006, 13(16): 1915-1927. [5] Hsueh YP. Calcium/Calmodulin-Dependent Serine Protein Kinase and Mental Retardation. Ann Neurol 2009, 66:438-443. [6] Stafford RL, Ear J, Knight MJ et al. The molecular basis of the Caskin1 and Mint1 interaction with CASK. J Mol Biol, 2011, 412(1): 3-13. [7] Sun Q, Kelly GM. Post-translational modification of CASK leads to its proteasome-dependent degradation. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(1): 90-97. [8] Hsueh YP，Wang TF，Yang FC，et al．Nuclear translocation and transcription regulation by the membrane-associated guanylate kinase CASK/LIN-2．Nature，2000，404 (6775)：298-302. [9] Sun RJ, Su YY, Zhao XD,et al. Human calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase regulates the expression of p21 via the E2A transcription factor. Biochem.[J], 2009, 419: 457–466. - 4 -