论文研究-细胞同轴数字全息图自动聚焦再现算法研究 .pdf

发布时间：2022-05-29 发布人：admin 分类：说明书资料大小：0.45M 资料格式：pdf 举报版权申诉

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中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 5 10 15 20 25 30 35 40 细胞同轴数字全息图自动聚焦再现算法研究常义琴，郑小林，罗洪艳，金变** （重庆大学生物工程学院，重庆 400044）摘要：针对生物细胞无色透明的特点，结合同轴数字全息在细胞观测方面的优势，采用 Tenebaum 梯度判据函数(TEG)和 Prewitt 梯度判据函数(PRG)两种自动聚焦评价函数与卷积再现算法相结合，形成快速可靠的自动聚焦算法以确定全息图的适合等分尺寸及相应的最佳再现距离进行区域再现，进而拼接获得整幅全息图像的完整再现。结果表明，上述方法能还原出完整 CCD 感光面下的细胞同轴数字全息图包含的信息，可以更好地应用于生物细胞的计数分析及研究中。关键词：同轴数字全息；细胞；卷积再现算法；图像尺寸；自动聚焦中图分类号：O438.1 Research on Autofocusing Algorithm for Coaxial Digital Hologram CHANG Yiqin, ZHENG Xiaolin, LUO Hongyan, JIN Bian (School of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400044) Abstract: According to the characteristics of colorless transparent cells and the advantage of coaxial digital holography in cell observations, two kinds of autofocus evaluation functions, i.e. Tenebaum gradient function (TEG) and prewitt gradient function(PRG), were adopted to form a fast and reliable autofocus algorithm,with the aim to determine the appropriate size of a hologram and the corresponding optimal reproduction distance for the regional reproduction.Following that,the complete reproduction of the holographic image were generated by stitching. The results indicate that the above method can successfully restore the information contained in the coaxial digital hologram of cells corresponding to the whole CCD photosensitive surface. Therefore, it can be better applied to the counting analysis and research of biological cells. Keywords: in-line digital holography; cell; convolution reconstruction algorithm; image size; autofocus 0 引言数字全息技术是由 Goodman 等[1]在 1967 年提出的，其基本原理是用电荷耦合成像器件 CCD 代替普通全息记录材料记录全息图，用计算机模拟再现取代光学衍射的方式来获得再现像，实现了全息图记录、存储、处理和再现全过程的数字化[1-7]。特别是同轴数字全息具有光路结构简单、光源相干性要求低、后端光学元件少的特点，因而在细胞形态学研究、细胞动态过程监测等显微成像领域应用广泛。将实验所获得的细胞同轴数字全息图像进行数字再现就能对其进行较好的细胞计数和动态分析。并且随着 CCD 或 CMOS 图像传感器件分辨本领和像素数的大幅提高，使同轴数字全息在大视野的细胞观察及高通量的细胞计数方面更具优势。而再现距离是影响再现图像质量的重要参数。理论上，同轴数字全息的最佳再现距离应为记录距离，但由于受到待测样品折射率、厚度及光场分布不均匀的影响[8]，记录距离作者简介：常义琴（1993-），女，硕士，主要从事数字全息方面的研究通信联系人：罗洪艳（1976-），博士，副教授，主要从事医学图像处理、医用智能材料方面的研究. E-mail: cqu_lhy@163.com - 1 -

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 往往难以精确测定，因而需要借助自动聚焦方法以实测记录距离为参考利用对焦算法由计算机寻找确定最佳再现距离[9-12]。现有的自动聚焦研究主要针对书本封面[9]，人物像[10]，分辨率测试板[11-12]等，均为不流动的单一固定目标且目标对象只出现在全息图中心，因而再现过程也局限于该局部区域，而非整幅全息图再现。鉴于生物医学应用涉及对分散在整幅全息图中的细胞进行观察分析，因而需要对整幅细胞全息图像进行再现。不同尺寸的局部区域自动聚焦所得到的再现距离具有一定的差异性[13]，而如何确定合适尺寸的局部区域进行细胞全息图像的自动聚焦再现，成为有待解决的关键问题。本文针对生物细胞的无色透明特性和全息图像分割尺寸对自动聚焦再现算法确定再现距离的影响等问题，结合自动聚焦方法的优越性，将细胞全息图像等分为不同大小的区域进行再现自动聚焦评价验证，得到合适的再现距离，并用该再现距离对图像进行分区域再现拼接，从而得到整个 CCD 像元面的全幅细胞再现图像，并进一步进行去背景处理，去除背景干扰噪声，使得同一视野下的细胞图像得到完整呈现。 1 同轴数字全息记录及其再现原理全息记录是利用干涉原理，将物体发出的特定光波以干涉条纹的形式记录物光波前的全 45 50 55 部信息。同轴数字全息术的记录和再现过程中，物体，参考光及全息图平面中心共轴，即参 yxC ,( ) 考光和物光夹角为 0，光路比较简单。以表示再现光，同轴数字全息记录与再现光路示意如图 4-1 所示，CCD 记录的总光强为：表示参考光，表示物光， yxR ,( yxO ,( ) ) 60 全息图透射率：  yxO ,( )  yxR ,( yxI ,( )  yxO ,( )  yxR ,( 2)  2) * OO  * RR  * OR  * RO (1)  * OO  * RR  * OR  * RO (2) 65 70 75 物面 y0 x0 CCD 面 R y x 像面 y1 x1 O z0 记录距离 z1 再现距离图 1 数字全息记录和再现光路坐标示意图 Fig. 1 Schematic for recording and reconstruction of a digital hologram 假设物体位于 x0,y0 平面，CCD 位于 x,y 平面，再现像位于 x1,y1 平面，物面与 CCD 面距离为 z0，称为记录距离，像面与 CCD 面距离为 z1，称为再现距离。利用全息衍射再现的原理，用计算机模拟再现数字全息图。若用参考光的共轭光作为再现光，则全息图再现光场分布为： yxC ,( ) - 2 -

80 85 90 95 100 105 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn yxU ,( )  yxIyxC ,() ,( )  RC | 2 |  OC | 2 |  OCR '  CRO ' （3） 2 数字全息自动聚焦再现算法数字全息自动聚焦是让再现距离 z 在估计的记录距离附近以某一步长变化，得到一系列的再现像，通过多次迭代并根据聚焦函数的峰值来确定最佳聚焦位置，从而得到最清晰的再现像。图 2 就是整个自动聚焦再现算法的全过程，首先参考估计的记录距离，设置粗调再现距离，并进行全息再现，再运用自动聚焦评价函数判断各再现像的峰值，得到大概聚焦位置，然后参考峰值处再现距离，设置精调再现距离，继续全息再现，确定的聚焦函数峰值即为最佳聚焦位置，所对应的再现距离即为最佳再现距离，最后输出此再现距离对应的清晰再现像。已知原始信息图 2 自动聚焦再现算法过程图 Fig. 2 Flow chart of auto focus reconstruction algorithm 本文采用卷积算法实现全息再现。该算法可以在最佳再现距离附近一个非常小的范围内获得高分辨率再现像，且算法不涉及二次相位因子，也不会改变再现像像元大小，Sobel 算子与 Prewitt 算子可以很好的估计图像各方向梯度，由它们形成两种梯度判据函数的无偏性好、单峰性强、信噪比高、计算量小、灵敏度高，在聚焦平面附近具有明显变化趋势[14]。因此将其与梯度判据函数相结合，能够得到可靠的自动聚焦算法，并很好的应用于显微数字全息中。 2.1 卷积算法原理根据瑞利—索末菲衍射积分及全息原理，卷积再现算法表示为 yxgFyxHyxCFF zyxU , ,([   )] ) ,   ,( 为衍射在自由空间的脉冲响应[15] (4) ,)] i i i 1 ( [ 式中 F-1{·}表示二维傅里叶逆变换， exp[ ( 1 j  yxg ,( ) ,( yxg ,( ) 2 jk z ( i 2 z   ) i  x 2 ] x  2 y ) 2/12  y ) 2/12 . (5) 在数值重建中，卷积再现法需要完成 3 次快速傅里叶变换，像平面与全息图平面具有相表示离散化的脉冲响应，其中(－M/2≤k≤M/2－1,－N/2≤l≤N/2 ) ylxkg (  同的抽样间隔。用－1)为整数，其传递函数为 , ylxkgF )}, ({  (6) z x f /( ),   式中 m、n 为整数，且分别与 k，l 取值相同， i fnfmG    CV ( ) , , y x x i f  y y i z /(  ) i 。GCV 的带宽近似为尼奎斯特抽样要求 2 f x max  xM  z  i 2, f y max  yN  z  i . (7) - 3 -

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 110 2 f x max  2,1 x  f  y max .1 y  (8) 在再现时，用 zR 再现距离，zo 表示记录距离，只有当 zR=zo 时才能得到最清晰的再现像。由于在计算机数值再现过程中可以方便地改变 zR 的值，直到得到最清晰的像，即可以通过程序实现自动聚焦，在全息记录时不需要精确调节 zo 的值[16]。 2.2 Tenebaum 梯度判据函数(TEG) 115 TEG 判据函数是利用 Sobel 算子来估计图像在水平方向和垂直方向的梯度，为使图像边缘的梯度放大，对梯度进行平方运算[17]： M N 1  TEG  1  0 0 P 2 x  P 2 y (9) I(x-1)+y1,+I(x+y)1,+I(x*2+1)-y1,+I(x [=Px I(x [=Py I(x-1)-y1,+I(x+1)-y *2+1)-y 1,- I(x, I(x*2-1)-y1,- I(x-y)1,- I(x, y *2-1)   y1,+I(x-1) 21)]+y1,- 21)]  y1,- (10) (11) 120 2.3 Prewitt 梯度判据函数(PRG) 在数字图像处理中，用 Prewitt 算子与图像卷积也能很好地提取出图像的边缘来。提出用这种方法形成判据函数，称为 Prewitt 梯度判据函数(PRG)。其计算方法是将图像与 Prewitt 算子卷积，将结果平方再求和[18]： 125 130 135 140 Prewitt 梯度判据函数 PRG  1 1  M N  0 0 P 2 x  P 2 y I(x-1)+y1,+I(x+y)1,+I(x+1)-y1,+I(x [=Px I(x [=Py I(x-1)+y1,+I(x+1)+y +1)+y 1,- I(x, (12) I(x-1)-y1,- -1)-y1,- I(x, I(x-y)1,- -y1,+I(x-1)-y 21)]+y1,- 21)] (13) (14) 式中，图像的大小为 M×N；I(x,y)为再现像各像素点的灰度值；Px 和 Py 对应 x 方向和 y 方向的梯度。由上述原理可知，自动聚焦评价函数评价结果与所选取的图像像素数目多少有关系，即和 M、N 的取值有关，不同的图像大小会影响其聚焦结果。 3 实验结果与分析实验中采用的是本课题组的自制 LED 同轴数字全息成像装置获取的将培养液滴于载玻片作为待测样品的血细胞全息图。该成像装置由 LED 光源、微孔、CCD 传感器等构成，用于记录全息图的 CCD 具有 2448pixel×3264pixel，像元尺寸大小 1.75 m　 ×1.75 m　，记录距离约为玻片厚度 1.13mm，参考光波长为 470nm。实验所获得的全息图如图 3 所示，从图 3 中可以看到血细胞分布在整个视野范围，最中心蓝色方框部分截取出来如图 3 右侧所示，由图可见全息图干涉条纹明显，质量较好，而整幅全息图细胞数目较多，最中心区域光场分布均匀，视野清楚，选取该区域不同像素数目的血细胞全息图像，将其转化为灰度图像并运用自动聚焦再现算法验证。 - 4 -

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 图 3 血细胞原始数字全息图像 Fig. 3 Original digital hologram of blood cell 对同一幅全息图像，像元尺寸固定，用卷积再现算法对选择的不同像素数目的全息图像再现，运用 TEG 自动聚焦判据函数和 PRG 自动聚焦判据函数对重建的图像进行自动聚焦评价验证，以记录距离 1.13mm 为基准，先以 0.1mm 为步长在其附近进行粗调，最后在找到的粗调范围内以 0.01mm 步长变化进行精调，最终得到不同图像大小的全息图像对应的再现距离，并用该再现距离进行再现，对比全息图再现像效果，并与部分显微图像对比。表 1 不同尺寸的全息图像自动聚焦结果 Tab. 1 The results of auto focusing of hologram with different sizes 9 81 16 25 64 36 49 100 121 144 4 1224× 1632 816×10 88 612×8 16 490×6 52 408×5 44 350×4 66 306×4 08 272×3 62 245×3 26 223×2 96 204×2 72 4.99 6.04 2.47 1.12 1.12 1.12 1.12 1.08 1.10 1.10 1.10 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13 差差差差差差良良优优优全息图等分数目区域像素 /pixel 验证再现距离 /mm 记录距离 /mm 再现效果 145 150 由表 1 可以看出，当全息图所选区域大小到特定范围时，最佳再现距离将不在随图像尺寸改变而改变，而是趋于同一个值，直至选取图像大小在 300pixel×400pixel 范围内时，自动聚焦再现效果得到改善，把整幅全息图像等分 121 分，每一份占 223pixel×296pixel，选取图 3 最中心区域等分 121 大小的局部区域图像 223pixel*296pixel 运用自动聚焦算法进行实验验证，实验结果如图 4： 155 - 5 -

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn (a) X: 1.1 Y: 1 (b) 1 0.98 0.96 0.94 0.92 0.9 0.88 0.86 0.7 0.8 0.9 1.1 1 1.4 Reconstruction distance/mm 1.2 1.3 TEG PRG 1.5 1.6 1.7 图 4 聚焦评价函数曲线，(a)粗调；(b)精调 Fig. 4 Curves of focusing evaluation.(a)coarse adjusting;(b)fine adjusting 160 图 4(b)可以看到两种聚焦评价函数均是在再现距离为 1.1mm 时候具有峰值，与记录距离 1.13mm 接近，用卷积再现算法再现，并用形态学分割方法去除背景，与显微图像对比，得到如图 5 所示结果： (a) (c) (b) (d) 图 5 局部区域实验结果图。(a)灰度全息图；(b)再现像；(c)去背景再现像；(d)显微图像。 Fig. 5 Experimental result image of local area.(a)Hologram;(b)Reconstructed hologram; (c)After background ofreconstructed hologram;(d)Microscopic image of blood cells. 图 5(b)中可以明显看到，再现像虽然存在部分干涉条纹，但是细胞图像已经清晰呈现，经过去背景处理后，细胞清晰明辨，和显微图像对应一致。将此再现距离及图像像大小应用到整幅图像平均等分的每一个区域，对 121 分等分的全息图一一再现，再将所有的小分块再现像拼接在一起，最后运用形态学的处理方法对再现像去背景，得到如图 6 所示的最终处理图像。使得一幅完整的血细胞全息图得到完整呈现，由于整幅图像细胞数目较多，血细胞尺寸小，整幅图像尺寸过大，故而肉眼观测不如局部区域的血细胞结构分辨明显。 - 6 - 165 170

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 175 Fig. 6 Complete hologram after background of reconstruction of blood cells. 图 6 完整的血细胞全息图去背景再现像 4 结论同轴数字全息能够充分利用 CCD 的空间带宽，且对 CCD 的分辨率要求较低，再现像散斑噪声较低，较宽的记录距离范围使得光路的安排可以较为灵活。本文基于同轴数字全息成像技术所得到的血细胞全息图，采用 TEG 和 PRG 两种自动聚焦评价函数与卷积再现算法 180 相结合，形成快速可靠的自动聚焦算法，在不用调整记录距离的情况下，充分利用自动聚焦再现算法的优越性，参考记录距离，验证合适的再现距离和与之匹配的全息图像等分尺寸，并将图像进行局部再现后拼接成一幅完整的细胞图像，并利用形态学的方法去除了背景杂质，得到清晰且可与显微图像相媲美的细胞图像，充分利用了高分辨率的 CCD 感光面，能进行高通量的细胞观测与分析，在今后有望将此方法运用于细胞计数分析方面。 185 [参考文献] (References) 190 195 200 [1] Goodman J W, Lawrence R W. Digital image formation from electronically detected holograms[J]. Applied physics letters, 1967, 11(3): 77-79. [2] Gabor D. A new microscopic principle[J]. Nature, 1948, 161(4098): 777-778. [3] Seo S, Su T W, Tseng D K, et al. Lensfree holographic imaging for on-chip cytometry and diagnostics[J]. Lab on a Chip, 2009, 9(6): 777-787. [4] Schnars U, Jüptner W. Direct recording of holograms by a CCD target and numerical reconstruction[J]. Applied optics, 1994, 33(2): 179-181. [5] Kronrod M A, Merzlyakov N S, Yaroslavskii L P. Computer synthesis of transparency holograms[J]. Soviet Physics Technical Physics, 1972, 17: 329. [6] Schnars U, Jüptner W P O. Digital recording and numerical reconstruction of holograms[J]. Measurement science and technology, 2002, 13(9): R85. [7] Schnars U, Kreis T M, Ju W P O. Digital recording and numerical reconstruction of holograms: reduction of the spatial frequency spectrum[J]. Optical Engineering, 1996, 35(4): 977-982. [8] 郭荣礼. LED 照明的数字全息显微研究[D]. 中国科学院研究生院 (西安光学精密机械研究所), 2014. [9] 孙杰,袁跃辉,王传永.数字图像处理自动图像聚焦算法的分析和比较[J].光学学报,2007, 27(1): 35-39. [10] 刘长庚,王大勇,张亦卓,等.数字全息成像中基于导数的自动对焦算法[J].中国激光,2009 (11):2989-2996. [11] 王华英,刘景波,王大勇,等.显微数字全息数值再现中的自动聚焦[J].光学学报,2008,28(2):343-347. - 7 -

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 5 [12] 王华英,王广俊,王大勇,等.数字全息显微中的自动聚焦[J].光电子.激光,2010,21(8): 1232-1236. [13] 张燕. 数字全息成像及其自动聚焦的理论与实验研究[D]. 济南:山东师范大学, 2007. [14] 朱孔凤. 数字图像处理在自动聚焦系统中的应用[D]. 济南: 山东大学, 2006. [15] Kreis T M, Adams M, Jüptner W P O. Methods of digital holography: a comparison[C]//Lasers and Optics in Manufacturing III. International Society for Optics and Photonics, 1997: 224-233. [16] 王广俊,王大勇,王华英.数字全息显微中常见重建算法比较[J].激光与光电子学进展,2010(3):83-88. [17] 刘迪,王玉荣,孟祥锋,等.Gabor 同轴数字全息的多重再现与自动聚焦[J].中国激光,2014 (9):230-238. [18] Gonzalez R C, Woods R E. Image processing[J]. Digital image processing, 2007, 2. - 8 -

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