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大豆蛋白及其酶解产物对桑椹花色苷色素热稳定性的影响研究.pdf
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大豆蛋白及其酶解产物对桑椹花色苷色素
热稳定性的影响研究 #
江玉婷，何志勇，陈洁，秦昉，曾茂茂**
（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）
摘要：在 pH 6.3 条件下，探究不同浓度的大豆蛋白（Soy protein, SP）及其碱性蛋白酶酶解
产物（SP-J），木瓜蛋白酶酶解产物（SP-M），胃蛋白酶酶解产物（SP-W）对桑椹花色苷
提取物（Mulberry anthocyanin extract, MAE）热稳定性的影响，并利用荧光光谱法对四种蛋
白与 MAE 中主要花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside, C3G）的相互作用
进行研究。结果表明，SP，SP-J，SP-M，SP-W 对 MAE 热处理（42℃/5 天）中的降解均有
抑制作用，其最佳添加浓度分别为 0.2，2，2，1 mg/mL（MAE 浓度为 0.5 mg/mL），对总
花色苷热降解率可分别减少 11.1%，48.2%，32.3%和 50.6%，三种酶解产物效果均优于 SP。
荧 光 猝 灭 分 析 显 示 ， 四 种 蛋 白 与 C3G 存 在 分 子 相 互 作 用 ， 结 合 作 用 强 度 大 小 为 ：
SP-J>SP-W>SP-M>SP，且 SP，SP-M，SP-W 主要通过疏水相互作用与 C3G 结合，而 SP-J
与 C3G 结合主要通过静电引力。本研究表明 SP 及其酶解产物可以提高 MAE 的热稳定性，
其保护效果与蛋白-花色苷作用强度呈正相关。
关键词：食品科学；大豆蛋白；酶解产物；花色苷；稳定性；相互作用
中图分类号：TS201
Effects of Soy Protein and Its Enzymatic Hydrolysates on
the Thermal Stability of Anthocyanin Pigment in Mulberry
JIANG Yuting, HE Zhiyong, CHEN Jie, QIN Fang, ZENG Maomao
(State Key Lab of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122)
Abstract: To explore the effects of different concentrations of soy protein (SP) and its Alcalase
hydrolysate (SP-J), Papain hydrolysate (SP-M) and Pepsin hydrolysate (SP-W) on the thermal stability
of mulberry anthocyanin extract (MAE) at pH 6.3, the interactions between four proteins and
cyanidin-3-O-glucoside (C3G), the main anthocyanin in MAE, were studied by fluorescence
spectroscopy. The results showed that SP, SP-J, SP-M, and SP-W all had an inhibitory effect on the
degradation of MAE during heat treatment (42℃ for 5 days). The optimal addition concentrations were
0.2, 2, 2, 1 mg/mL (concentration of MAE was 0.5 mg/mL) and the thermal degradation rate of total
anthocyanins can be reduced by 11.1%, 48.2%, 32.3% and 50.6%, respectively. The inhibitory effects
of three kinds of enzymatic hydrolysates were better than SP. Fluorescence quenching analysis showed
that molecular interactions existed between the four proteins and C3G, and the strength of binding
affinity was as follows: SP-J> SP-W> SP-M> SP. SP, SP-M and SP-W interacted with C3G mainly
through hydrophobic interactions, while SP-J was combined with C3G through electrostatic force. This
study showed that SP and its enzymatic hydrolysates can improve the thermal stability of MAE, and its
protective effect was positively correlated with the intensity of the protein-anthocyanin effect.
Key words: food science; soy protein; enzymatic hydrolysate; anthocyanin; stability; interaction
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：31771978）；江南大学食品大豆蛋白及其酶解产物对桑椹花色
苷色素热稳定性的影响研究科学与技术国家重点实验室自由探索项目（编号：SKLF-ZZB-201801）；中央
高校基本科研业务费专项资金项目（编号：JUSRP21802）；食品科学与工程国家一流学科建设项目（编号：
JUFSTR20180201）
作者简介：江玉婷（1995-），女，主要研究方向：食品加工与组分变化
通信联系人：何志勇（1977-），男，教授，博导，主要研究方向：食品加工与组分变化. E-mail:
zyhe@jiangnan.edu.cn
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0 引言
花色苷作为一种水溶性的天然色素，属于黄酮类活性物质，广泛来源于植物的根、叶、
朵、果实中。在低 pH 值时，花色苷呈现明亮的红色调，随着 pH 值升高，变为紫色和蓝色
[1]。桑椹是一种药食同源的水果，富含花色苷类物质，具有抗氧化性、抗炎以及降低糖尿病、
45
肥胖症风险等促进健康的功能[2-4]，但是其在水溶液中极易受到温度、光照、pH、酶等因素
的影响[1]，在食品加工过程中易大量损失。
目前，很多研究都表明蛋白质可以对花色苷进行稳定和保护，尤其是食品中本身存在的
蛋白或者能作为食品配料使用的蛋白，如乳蛋白[5, 6]，有报道探究不同乳蛋白组分（β-乳球
蛋白、酪蛋白等）与花色苷的相互作用对葡萄皮花色苷提取物的稳定性有积极的影响[7-9]；
50
酵母甘露糖蛋白对蓝莓酒中的花色苷以及对中性条件下花色苷都具有保护作用[10, 11]。近年
来，随着人们对植物基产品的追求，研究者们目光集中在植物蛋白如大豆蛋白及预热大豆蛋
白对花色苷的稳定性影响方面[12, 13]。有研究表明有限的水解会改变蛋白的结构，暴露出更
多的电离或者疏水基团，并产生多肽[14, 15]。然而现在关于酶水解后的大豆蛋白对花色苷稳
定性有何影响及其内在的蛋白-花色苷相互作用情况的研究鲜有报道。
55
因此，本文研究目的在于在 pH 6.3 下大豆蛋白及其三种酶解产物对桑椹花色苷提取物
（MAE）颜色热稳定性和花色苷降解的影响，并结合荧光猝灭法探究大豆蛋白及其酶解产
物与花色苷的相互作用。研究结果有望促进 SP 及其酶解产物在花色苷类天然色素稳定化方
面的应用。
1 材料与方法
60
1.1 材料
桑椹花色苷提取物（Mulberry anthocyanin extract, MAE；总花色苷含量约为 50%），购
于天津尖峰生物科技有限公司；矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside, C3G；纯度
≥90%）购于南京春秋生物工程有限公司；大豆脱脂豆粕，来自于平顶山金晶生物科技股份
有限公司；胃蛋白酶（3000 U/mg），购于生工生物工程（上海）股份有限公司；碱性蛋白
65
酶（>2000 U/mg），购于杜邦公司；木瓜蛋白酶（>2000 U/mg），购于生工生物工程（上
海）股份有限公司；其他所用试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 制备大豆蛋白（Soy protein, SP）及其酶解产物
按文献[16]方法稍作修改制备 SP。将脱脂豆粕以 1:10（w/v）用去离子水分散，用 2 M 的
70
NaOH 调节 pH 至 8.0，室温搅拌 2 h，离心（10000 g，20 min），取上清，将上清液用 2 M HCI
调节 pH 至 4.5，静置 30 min，离心（3300 g，20 min），可获得大豆蛋白沉淀，沉淀加去离
子水复溶，调节 pH 至中性，冷冻干燥后备用。
按文献[17]方法稍微修改制备大豆蛋白木瓜蛋白酶酶解产物（SP-M）和碱性蛋白酶酶解
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产物（SP-J）。将 5%(w/v)的 SP 分散溶液 90℃预热处理 10 min，冷却至室温。随后调节 pH
75
（SP-J 为 pH 8.0，SP-M 为 pH 7.0），一定酶解温度下按 E/S 比为 1%加入木瓜蛋白酶和碱
性蛋白酶，过程中保持 pH 恒定。酶解 10 min 后，水解物在 90℃下加热 10 min，使酶失活，
立即用冰水冷却至室温，调节 pH 至中性，离心 (9000 g，15 min)，将上清液经冷冻干燥备
用。
按文献[17]方法稍微修改制备大豆蛋白胃蛋白酶酶解产物（SP-W）。将 5%(w/v)的 SP 分
80
散溶液 90℃预热处理 10 min，冷却至室温。随后 pH 调至 2.0，在 37℃下，按 E/S 比为 1%
加入胃蛋白酶，酶解 10min 后立即用 2M NaOH 将 pH 调至 7.0，随后在 90°C 下加热 10 min，
使酶失活，立即用冰水冷却至室温，调节 pH 至中性，离心 (9000 g，15 min)，将上清液经
冷冻干燥备用。
1.2.2 制备 SP，SP-J，SP-M，SP-W 与 MAE 的混合物体系
85
将 MAE 粉末分别溶解在 pH 6.3 的 20 mM 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，制成 1 mg/mL
的 MAE 母液（现配现用）。按照不同比例将 SP，SP-J，SP-M，SP-W 和 MAE 母液混合，
室温下搅拌 2 h，得到系列混合物。最终混合体系中蛋白及其酶解产物的浓度别为 0、0.1、
0.2、1、2、4 mg/mL，MAE 浓度为 0.5 mg/mL，无蛋白体系为对照样品。
1.2.3 降解加速试验
90
取 10 mL 样品分装在螺纹玻璃瓶中，充氮后放入 42℃避光条件下的恒温培养箱中储藏
5 天，进行热加速试验。5 天后分别取样进行颜色和花色苷含量测定。
1.2.4 颜色测量
使用全自动测色色差计（WB-2000IXA 型号）测定样品的 L*（亮度）、a*（红绿度）、
b*值（黄蓝度），并用以下公式计算出色度值（C*），色调角（h*）和色差指数（ΔE）值[18]:
95
h*在 0°或者 360°显示为红色，90°为黄色，180°为绿色，270°为蓝色；C*颜色的饱和度
（C*值越高越鲜艳）；总色差△E 值表示目标样品与对照样品之间的颜色差异大小。
100
1.2.5 高效液相色谱法测定花色苷含量
样品经 0.45 μm 微滤膜过滤后，使用 Waters 高效液相色谱（Waters 2487 UV 检测器）
测定花色苷含量。色谱分析柱为 TSK-GEL ODS-100V C18 柱（250×4.6 mm, 5 μm）。以 2%
甲酸水溶液为流动相 A，以 100%乙腈为流动相 B，柱温 30℃，进样量 10 μL，检测波长 513
nm，流速为 1 mL/min，洗脱条件为：0 min，2% B；0-20 min，6-16% B；20-28 min，16-23%
105
B；28-30 min，23-50% B；35-37 min，100% B；37-40 min，100-2% B。利用峰面积积分和
C3G 标准品的校正曲线对 MAE 中的各种花色苷组分进行定量，相加得到总花色苷的含量。
MAE 中总花色苷降解率按照如下公式计算：
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1.2.6 鉴定 MAE 中花色苷组分
110
使用 WATERS UPLC MALDI SYNAPT QTOF-MS 鉴定 MAE 中花色苷种类，色谱柱为
BEH C18，100 mm × 2.1 mm i.d，孔径为 1.7 μm，柱温设置为 45℃，进样量为 5 μL，检测
波长为 520 nm。流速为 0.3 mL/min，流动相和洗脱梯度同 1.2.5。设置双通道，正离子模式
检测，质谱范围 m/z 50-2000，1 通道和 2 通道的碰撞能量分别为 6.0 eV 和 25.0 eV，毛细管
电压为 3.0 kV，锥孔电压为 30.0 V，锥孔气流速和脱溶剂气流速分别为 10 L/h 和 700 L/h，
115
离子源温度和脱溶剂气温度分别为 100ºC 和 400ºC。
1.2.7 荧光光谱法
使用 F-2700 型荧光光谱仪（日本日立公司）测定荧光光谱。制备 SP，SP-J，SP-M，SP-W
与 C3G 的混合物，蛋白浓度为 0.3 mg/mL，C3G 浓度分别为 0, 10, 20, 40, 60, 80 μM。激发
波长设为 280 nm，在 300-500 nm 之间测定样品的发射荧光光谱，狭缝为 5 nm。混合样品荧
120
光值扣除缓冲液和相应浓度 C3G 溶液的背景荧光值即为样品中蛋白的荧光值。
1.2.8 统计分析
所有实验均进行三次。采用 Statistix 9.0 软件进行数据统计分析，显著水平为 p < 0.05。
2 结果与讨论
2.1 MAE 中花色苷组分的鉴定
125
图 1 MAE 的色谱图，峰 1 的一级质谱图（A），峰 2 的一级质谱图（B），峰 2 的二级质谱图（C）
Fig. 1 Chromatogram of anthocyanins,first mass spectra of peak 1 (A), first mass spectra of peak 2 (B), second
mass spectra of peak 2 (C)
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表 1 42℃热处理 5 天条件下添加不同浓度大豆蛋白及其酶解产物的桑椹花色苷提取物的颜色值
Tab.1 Effect of different concentration SP, SP-J, SP-M, SP-W on colorimetric parameters of MAE after
thermal treatment (42℃ for 5d) at pH 6.3
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135
经 UPLC-MALDI QTOF-MS 分析，根据图 1 中分子量和碎片离子分析推测含有两个目
标峰，说明 MAE 中含有两种花色苷单体。由图 1 所示，花色苷单体峰 1 的分子离子为 m/z
=449，离子碎片 m/z =287；单体峰 2 的分子离子为 m/z =595，离子碎片也为 m/z =287，分
别失去一个质量为 162 和 308 的中性碎片。结合相关文献确定峰 1 为 C3G，峰 2 为矢车菊
素-3-O-芸香糖苷（Cyanidin-3-O-rutinoside, C3R）[19]。此外，根据峰面积计算，可确定 MAE
140
中 C3G 和 C3R 分别占 63.3%和 36.7%。
2.2 不同浓度 SP，SP-J，SP-M，SP-W 对 MAE 热稳定性的影响
表 1 所示为经过 5 天 42℃的热处理前后，添加不同浓度的大豆蛋白及其三种酶解产物
的样品色度值的变化。在经过 5 天 42℃的热加速处理之后，所有样品虽然变化程度不同，
但都呈现 L*，C*，h*值升高的结果，表现为溶液变得更透明，颜色强度更高，由紫红色向
145
黄色调转变，根据先前的报道，L*值的升高与形成了透明的降解物有关[20]，h*值的升高是
因为在 pH 6.3 体系（近中性环境）中，溶液中的花色苷开环降解，形成淡黄色的查尔酮的
形式[20, 21]。随着蛋白或者酶解产物添加量的增加，样品起始的 L0*值和 C0*值都随之降低，
这是因为过量添加蛋白会提高样品的浊度。
从表 1 中的 ΔE 可以看出，所有添加蛋白或者酶解产物样品的 ΔE 值均低于对照样品，
150
表明其对 MAE 热降解均有不同程度的抑制作用。对添加 SP 而言，浓度为 4 mg/mL 时，ΔE
值最小。但是值得注意的是，当 SP 浓度为 1-4 mg/mL 时，ΔE 差异并不明显，且浓度越高
对 MAE 样品初始颜色影响越大。对添加 SP-J 和 SP-M 组而言，分别在浓度为 1-4 mg/mL 和
2-4 mg/mL 时达到最佳颜色保护效果，添加 SP-W 组的 ΔE 呈现随蛋白浓度增大先降低后升
高趋势，在 1 mg/mL 时达到最佳颜色保护效果，且蛋白或不同酶解产物对 MAE 颜色保护效
155
果排序为：SP-J≈SP-W>SP-M>SP。之前也有研究表明大豆蛋白是通过与花色苷的结合作用
从而对其有一定的保护效果[12]，在此推测大豆蛋白通过不同酶进行水解后，可不同程度地
增加酶解产物与花色苷的结合作用，因此呈现出对花色苷颜色更好的保护效果。
图 2 5 天 42℃热处理条件下添加不同浓度 SP，SP-J，SP-M，SP-W 时 C3G 含量(A)，C3R 含量(B)，
160
总花色苷含量(C)的降解率
Fig.2 Effect of different concentration SP, SP-J, SP-M, SP-W on degradation rate of C3G(A), C3R(B) and
total anthocyanin(C) after thermal treatment (42℃ for 5d) at pH 6.3
- 6 -
0.10.21240255075100C3G含量的降解率 (%)大豆蛋白及其酶解产物的浓度 (mg/mL) SP SP-J SP-M SP-W对照样A0.10.21240255075100BC3R含量的降解率 (%)大豆蛋白及其酶解产物的浓度 (mg/mL) SP SP-J SP-M SP-W对照样0.10.21240255075100C总花色苷含量的降解率 (%)大豆蛋白及其酶解产物的浓度 (mg/mL) SP SP-J SP-M SP-W对照样
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根据定量分析，在 pH6.3 条件下，MAE 样品中总花色苷含量为 242.22 mg/mL，其中 C3G
和 C3R 的含量分别为 172.73 mg/mL 和 69.60 mg/mL。如图 2 所示，与对照样品中降解率达
165
到 97.3%相比，不同浓度的四种蛋白或酶解产物均能有效抑制 42℃热处理过程中 MAE 花色
苷的降解，起到保护效果。SP，SP-J，SP-M 和 SP-W 的最佳添加浓度分别为 0.2，2，0.2-2，
1 mg/mL，总花色苷降解率分别降至 85.5%，50.4%，65.9%-68.7%，48.1%，可分别减少花
色苷降解 11.1%，48.2%，29.4%-32.3%和 50.6%，显然三种酶解产物的保护效果要比大豆蛋
白更佳，这与上述 MAE 溶液总色差变化结果基本一致。例外的是在添加 0.2-1 mg/mLSP-M
170
时，其 ΔE 值显著大于添加 2 mg/mL 时，但三个不同添加浓度下的花色苷降解率分别为
68.7%，67.5%，65.9%，并无显著性差异（p>0.05），热处理中花色苷含量损失要低于颜色
损失的现象，可能是因为颜色的损失并不仅仅因为花色苷的降解，还可能是因为花色苷从单
体变成了聚集体或者与酶解产物形成了复合物而造成[22, 23]。对单体花色苷而言，添加 SP，
SP-J，SP-M，SP-W 后，与未添加蛋白相比，C3G 的热降解率分别减少了 11.4%，47.5%，
175
28.4%，48.9%，C3R 降解率分别减少了 14.0%，49.3%，45.8%，54.2%，可以看出 SP，SP-J，
SP-W 抑制 C3G 和 C3R 热降解的效果是相近的，而 SP-M 对 C3R 的保护效果要略强于对 C3G。
2.3 SP，SP-J，SP-M，SP-W 荧光光谱分析
图 3 添加不同浓度的 C3G 时，SP（A），SP-J（B），SP-M（C），SP-W（D）的荧光猝灭图谱
180
注：C3G 的浓度分别为 0，10，20，40，60，80 μM（1-6）
Fig.3 Fluorescence spectra of SP(A), SP-J(B), SP-M(C), SP-W(D) in the presence of 0, 10, 20, 40, 60 and 80 μM
C3G (1–6) at pH 6.3.
内源荧光光谱分析被广泛地运用于研究蛋白质在水环境中的结构变化和获取小分子与
蛋白质相互作用的结合信息[7, 24]。蛋白质具有天然荧光，在 280 nm 的激发波长下，主要是
185
来源于芳香族氨基酸——酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）[25]。图 3 显示了 SP，SP-J，SP-M，
SP-W 在 0-80 μM C3G 存在下的荧光光谱。SP，SP-J，SP-M，SP-W 的荧光强度都随着 C3G
浓度的增加而降低，表明 C3G 对其都有浓度依赖型的猝灭效应。80 μM C3G 对四者的猝灭
率分别为 62.7%，65.8%，61.7%，64.2%。在未加入 C3G 条件下，SP，SP-J，SP-M，SP-W
最大荧光发射波长（λmax）分别为 334 nm，344 nm，346.5 nm，338.5 nm，可见三种酶解产
物的 λmax 相比 SP 均发生不同程度的红移，说明酶解导致 SP 中 Trp 荧光发色基团更接近蛋
白分子表面位置[26]，更明显地暴露在极性环境中，SP 酶解后可能结构更展开，疏水性更高
190
- 7 -
3003504004505000200400600800100012001400300350400450500010020030040050060070030035040045050001002003004005006007008003003504004505000100200300400500600700800荧光值波长 (nm)16AB荧光值波长 (nm)16C荧光值波长 (nm)16D荧光值波长 (nm)16
195
200
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[27]。而且在经过碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后，在 310 nm 处出现了一个小肩峰，这可能
是因为酶解导致本在内部的 Tyr 残基大量暴露出来[27]。并且随着 C3G 浓度增加，SP 和 SP-W
的 λmax 未见变化，而 SP-J 和 SP-M 的 λmax 均红移 1.5 nm，说明 SP-J 和 SP-M 的氨酸残基所
处的微环境稍有变化，疏水性减小，极性增加。
2.4 C3G 对 SP，SP-J，SP-M，SP-W 的荧光猝灭分析
小分子（猝灭剂）对蛋白（荧光团）的荧光猝灭机制可分为动态的（两者碰撞导致猝灭），
静态的（两者形成不发光的复合物导致猝灭），或者两者兼而有之[28]。接下来用 Stern-Volmer
方程对荧光猝灭数据进行了分析：
式中，F0 和 F 分别为荧光分子与猝灭剂（C3G）作用前后的荧光强度，KSV 为 Stern-Volmer
猝灭常数，Kq 为生物大分子猝灭速率常数，cq 为猝灭剂浓度，τ0 为猝灭剂不存在时荧光分子
的寿命，一般为 10-8 s。一般来说静态猝灭形成的复合物稳定性较低，随着温度升高，其猝
灭常数会随之降低，而动态猝灭相反，温度升高会促进猝灭剂与发色团的碰撞而使动态猝灭
常数增加[29]。如图 4 中 Stern-Volmer 曲线和表 2 中的数据显示，SP，SP-J，SP-M，SP-W 在
3 种温度下的 Kq 值均远远大于（超过两个数量级）各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰
撞猝灭常数（2×1010 L·mol-1·s-1）[30]，说明了静态猝灭的存在。但同时又观察到随着温度的
升高，SP 的 KSV 值有所升高，且 SP-J，SP-M，SP-W 的 KSV 值没有显著性差异。由此说明，
C3G 对 SP，SP-J，SP-M，SP-W 的荧光猝灭可能都是静态和动态猝灭兼而有之，这与之前
210
C3G 与大豆蛋白、人血清蛋白的猝灭机制研究结果一致[12, 31]。
图 4 不同温度下 SP（A），SP-J（B）,SP-M（C），SP-W（D）与 C3G 的 Stern-Volmer 曲线
Fig.4 The Stern–Volmer plots for the quenching of SP(A), SP-J(B), SP-M(C), SP-W(D) by C3G at 300, 308 and
215
316 K
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203040506070801.01.52.02.53.03.501020304050607080901.01.52.02.53.03.501020304050607080901.01.52.02.53.001020304050607080901.01.52.02.53.03.54.04.5 300K 308K 316KF0/FC3G浓度 (μmol/L)A 300K 308K 316KF0/FC3G浓度 (μmol/L)B 300K 308K 316KF0/FC3G浓度 (μmol/L)C 300K 308K 316KF0/FC3G浓度 (μmol/L)D
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