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pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒的构建与鉴定 .pdf

发布时间：2022-06-14 发布人：admin 分类：说明书 资料大小：0.41M 资料格式：pdf 举报 版权申诉
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    中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn pEGFP-N1/BMP-2 真核表达质粒的构建与鉴定 张明磊，常非，高忠礼，柳扬，刘光耀* 吉林大学中日联谊医院 骨科，长春 (130021) E-mail:z.m.l@sohu.com 摘 要:目的 构建 pEGFP-N1/BMP-2 真核表达质粒，并进行鉴定。方法 利用 RT-PCR 方法 从组织中提取骨形态发生蛋白（BMP-2）的基因片段，与 pMD18-T 载体连接，构建 pMD18-T/BMP-2 重组质粒，酶切后与 pEGFP-N1 真核表达载体连接，构建 pEGFP-N1/BMP-2 真核表达质粒，进行测序、酶切鉴定，表明质粒构建成功。结果 本实验成功构建了 pEGFP-N1/BMP-2 真核表达质粒，为进一步研究利用 BMP-2 基因修饰骨组织工程骨种子细 胞提供实验基础。 关键词：pEGFP-N1；骨形成蛋白 2；基因 中图分类号：R34 文献标识码:A 在新生骨组织的形成过程中，多种相关细胞因子参与其中并起到十分重要的作用，通过 细胞因子的浓度发生改变，继而通过募集祖细胞，发挥调节细胞的增殖和分化等作用。BMPs 是一种能够启动成骨分化，并作用于整个成骨过程的细胞因子。其中 BMP-2 被认为具有最 强的诱导成骨能力。并已广泛用于骨组织工程学。外源性细胞因子的使用存在生物半衰期较 短，在体内较快降解且易随体液扩散，很难在损伤区保持足够时间的有效生物活性等缺点。 随着基因工程和分子生物学技术的发展，现在已经能够将目的基因导入靶细胞，进而持续、 稳定、高效的表达，为细胞因子提供了良好的应用方法。本实验构建 pEGFP-N1/BMP-2 真 核表达质粒，并进行测序及酶切鉴定，为进一步研究利用 BMP-2 基因修饰骨组织工程骨种 子细胞提供实验基础。 1 材料和方法 1.1 材料 胎鼠，pEGFP-N1 载体（Clotech 公司），TRIzol Raegent（Invitrogen 公司），大肠杆菌 Top10 感受态细胞（广州威佳科技有限公司），DEPC（Sigma 公司），AxyPrep DNA 凝胶 回收试剂盒、AxyPrep 质粒 DNA 小量提取试剂盒（Axygen 公司），限制性内切酶（TaKaRa 公司）。 1.2 方法 1.2.1 引物设计 根据 GenBank 上 BMP（登陆号 NM_017178）序列，应用 Primer Prim5.0 软件设计、合 成 PCR 引物。 BMP1:5' TAGTGCTTCTTAGACGGACTGCGGT 3' BMP2: 5' ggtacca ATGGTGGCCGGGACCCGCTGTCTTC 3' 1223bp 1182bp 1.2.2 组织 RNA 提取及逆转录 将样品中加入 TRIzol Reagent 研磨均匀，提取总 RNA，之后按照逆转录试剂盒说明合 成 cDNA。 1.2.3 RT-PCR 扩增目的基因 PCR 扩增条件如下: 94 ℃变性 5 min , 94 30 s℃ 、55 45 s℃ 、72 35 s ℃ 循环 40 次后,72 -1-
    中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn ℃最后延伸 5 min 。取扩增终产物与 DL2000marker 一起进行琼脂糖凝胶电泳。切下目的条 带,按胶回收试剂盒说明从琼脂糖凝胶中回收 PCR 扩增产物 BMP-2 的 cDNA 片段。 1.2.4 PCR 产物的 TA 克隆 取回收的基因片段，µl 加 1µl pMD18-T 质粒 DNA，16℃反应 2-3h，-20℃保存。在 100µl 感受态细菌中，加 10µl(≤50ng)重组质粒 DNA，进行转化。小量快速制备质粒，用限制性内 切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性重组质粒 DNA。 1.2.5 构建 pEGFP-N1/BMP-2 真核表达质粒 分别取含目的基因的 T 载体进行双酶切，质粒 pEGFP-N1 同时进行相应双酶切，1%琼 脂糖凝胶电泳后，回收目的片段和线性载体，定向匹配连接，转化大肠杆菌 Top10 感受态 细胞。经卡那霉素抗性筛选后，提取质粒，酶切鉴定。 1.2.6 DNA 序列测定 由上海英骏生物技术有限公司完成 2 结果 2.1 RT-PCR 扩增 BMP2 将组织 RNA 进行反转录，应用套式 PCR 扩增 BMP2，琼脂糖凝胶电泳显示，在理论分 子量范围出现目的条带（见图 1）。 BMP-2 M A 图 1 RT-PCR 扩增 BMP A：RT-PCR 扩增 BMP M：DNA marker(DL2000，从上往下依次为 2000bp,1000bp,750bp,500bp, 250bp,100bp) 2.2 PCR 产物 TA 克隆 将上述所得的 DNA 片段与 pMD18-T 载体连接，进行 TA 克隆，转化 Top10 感受态细 胞，经 Amp 抗性筛选后，摇菌，小量提取质粒，BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，图中 2700bp 处为 pMD18-T 线性载体.因 BMP2 基因序列内有一 HindⅢ酶切位点,故在 500bp 及 600bp 左 右处出现两个片段（见图 2）。 -2-
    中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn A1A2B1B2C1C2D1D2 E1E2 F1F2 G1G2 M 图 2 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定 pMD18-T/BMP2w A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1：重组质粒 pMD18-T/BMP2w A2、B2、C2、D2、E2、F2、G2：BamHⅠ和 HindⅢ双酶切 pMD18-T/BMP2w M：DNA marker(DL2000) （DL2000，由上至下：2000，1000，750，500，250，100bp） 线性 pMD18-T 以质粒 pMD18-T/BMP2w 为模板，应用 BMP2 的内引物扩增，获得 BMP2 DNA（见图 3），回收此 DNA 片段，与 pMD18-T 载体连接，进行 TA 克隆，转化 Top10 感受态细胞， 经 Amp 抗性筛选后，摇菌，小量提取质粒，KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切鉴定，结果如图 2.17。 命名为 pMD18-T/BMP2。选取阳性克隆测序，结果如图4，将此序列在GenBank 上进行 BLAST 分析，结果与 GenBank 登录序列基本一致。 BMP2 A B C D M 图 3 以质粒 pMD18-T/BMP2w 为模板，应用内引物扩增 BMP2 A--D：应用内引物扩增的 BMP2 M：DNA marker(DL2000) （DL2000，由上至下：2000，1000，750，500，250，100bp） -3-
    中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 线性 pMD18-T BMP2 A1A2 B1B2C1C2 M 图 4 KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切鉴定 pMD18-T/BMP2 A1、B1、C1：KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切 pMD18-T/BMP2 A2、B2、C2：重组质粒 pMD18-T/BMP2 M：DNA marker(DL2000) （DL2000，由上至下：2000，1000，750，500，250，100bp） 2.3 BMP2 克隆入真核表达载体 pEGFP-N1 KpnⅠ、BamHⅠ分别双酶切 pMD18-T/BMP2、pEGFP-N1，琼脂糖凝胶电泳，回收线性 载体 pEGFP-N1 和 BMP2 片段，以 DNA Ligation Kit 连接，转化 Top10 感受态细胞，经 Kan 抗性筛选后，摇菌，小量提取质粒，双酶切鉴定，结果如图 6。 BMP2 线性 pEGFP-N1 A1A2B1B2C1C2D1D2 E1E2 F1F2M1M2 图 5 KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒 pEGFP-N1/BMP2 A1、B1、C1、D1、E1、F1：重组质粒 pEGFP-N1/BMP2 A2、B2、C2、D2、E2、F2：KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切重组质粒 pEGFP-N1/BMP2 M1：DNA marker(DL2000) （DL2000，由上至下：2000，1000，750，500，250，100bp） M2：1kb DNA marker（1kb DNA marker，由上至下：1000，2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000， 10000） 3 讨论 1965 年 Urist[1]报道将脱钙骨基质植入同种动物的肌肉内，结果可诱导异位新骨形成， 后来 DBM 经进一步分离提纯被证明是蛋白质分子，因此命名为骨形态发生蛋白，并证明了 骨诱导学说。研究证实，BMPs 是一组同源二聚体蛋白，为疏水性、酸性糖蛋白，由半胱氨 酸结合的两条特异性链组成，分子量约 30kD。1988 年 Wozney[2]等报道了人 BMP-1、BMP-2A、 -4-
    中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn BMP-2B（BMP-4）和 BMP-3 的 CDNA 克隆及表达，此后，学者们在这方面进行了大量的 研究工作，到目前为止，已发现至少存在 21 种 BMPs 亚型。在已发现的 BMPs 中，除了 BMP-1 是一种蛋白酶外，其它 BMP 均为 TGFβ 超家族成员。BMPs 是一组多功能细胞信号蛋白， 与细胞膜上两种受体 BMPI型受体（BMPR-I）和 BMPII型受体（BMPR-II）结合，激活 Smad 信号系统，激活或抑制细胞核内靶基因，从而改变包括生长、分化和细胞外基质的合成的细 胞的活性。BMP 能够促进未分化的间充质干细胞和成骨细胞的前体细胞向成骨细胞分化[3]， 其诱导方式主要是软骨内成骨。已有学者[4，5]将 BMP 应用到动物模型和临床病例中，表现 出良好的骨诱导性、化学趋向性和低抗原性等优点。目前研究报道较多的是 BMP-2，BMP-4 和 BMP-7，成骨能力较为明显。目前研究表明 BMPs 主要作为一种形态原，诱导未分化间 充质干细胞向软骨细胞、成骨细胞分化，抑制向其他方向分化。 80 年代末，学者们经过对 BMP 的编码和克隆，重组人骨形成蛋白(rhBMP)开始应用。 目前，己获得有良好诱导骨活性的 rhBMP-2 产品。但是，应用外源性 BMP 同样存在许多问 题，首先是复合 BMP 的载体存在着许多缺陷，限制着外源性 BMP 生物活性的正常发挥和 骨修复的进程。其次，BMP 作为一种蛋白质，生物半衰期较短，在体内较快降解且易随体 液扩散，很难在损伤区保持足够时间的有效生物活性，研究已证实 BMP 在植入局部的聚集 比 BMP 的总剂量更重要，且 BMP 的剂量必须超过一个阈值才能有效诱导骨形成。在外伤 骨折应用的剂量浓度为 1.5 mg/mL，而低浓度无效[6]。反复应用则增大了毒副作用和临床费 用。 转基因技术的发展，可以使 BMP-2 基因应用于局部，达到 BMP-2 在局部持续、稳定的 表达，更好的发挥其成骨作用。Cheng 等[7]用腺病毒携带骨形态发生蛋白-2 基因转染兔间充 质干细胞, 体外培养 1 周后可以检出骨形态发生蛋白-2 生成; 将转染的间充质干细胞移植到 自体横突间隙,观察到显著的促进骨生成作用。已有报道，在局部利用 BMP-2 基因用于治 疗骨缺损已获得了成功 [8]。本实验中，我们利用 RT-PCR 方法从组织中提取骨形态发生蛋 白（BMP-2）的基因片段，与 pMD18-T 载体连接，构建 pMD18-T/BMP-2 重组质粒，酶切 后与 pEGFP-N1 真核表达载体连接，构建 pEGFP-N1/BMP-2 真核表达质粒，进行测序、酶 切鉴定，表明质粒构建成功，为下一步的质粒转染工作打下了基础。 参考文献 [1] Urist MR. Bone formation by autoinduction. Science,1965,150(698): 893-899. [2] Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation：molecular clones and activities[J].Science.1988 16;242(4885):1528-34. [3] Kawasaki K，Aibara M，Honmo J，et al. Effects of recombinant Human bone morphogenetic protein 一 2 on differentiation of cells Isolated from human bone，muscle，and skin[J]. Bone，1998，23(3):223. [4] Cook SD, Salkeld SL, Brinker MR, et al. Use of an osteoinductive biomaterial(rhOP-1)in healing large segmental bone defects[J]. J Orthop trauma,1998,12(6):407-412. [5] Sellers RS, Zhang R, Glasson SS, et al. Repair of articular cartilage defects one year after treatment with Joint Surg Am.2000 recombinant human bone morphogenetic protein-2(rhBMP-2)[J].J Bone Feb;82(2):151-60. [6] Mussano F, Ciccone G, Ceccarelli M, et al. Bone morphogenetic proteins and bone defects: a systematic review[J]. Spine, 2007, 32(7):824-830. [7] Cheng SL, Lou J, Wright NM, et al. In vitro and in vivo induction of bone formation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene[J]. Calcif Tissue Int 2001;68(2):87-94. [8] Wang JC ， Kanim LE ， Yoo S ， et al.Effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone marrow cells on spinal fusion in rats[J].J Bone Joint Surg Am，2003，85(5):905-91. -5-
    中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn Construction and identification of eukaryotic expression vector pEGFP-N1/BMP-2 Zhang Minglei, Chang fei, Gao Zhongli, Yang Liu, Liu Guangyao China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun (130021) Abstract Objective To Construct a eukaryotic expression vector carrying BMP-2 gene.Methods BMP-2 gene was cloned from tissue by using RT-PCR method and was inserted into pMD18-T to constrcuct pMD18-T/BMP-2 plasmid,and to construct pEGFP-N1/BMP-2 plasmid by using restriction enzyme.To identify the plasmid by sequencing and restriction enzyme.Result The eukaryotic expression vector pEGFP-N1/BMP-2 was constructed and identified. Key words: pEGFP-N1;BMP-2;gene -6-
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